RNA isolation (TRIzol 사용 방법)

Material

1. TRIzol Reagent (Invitrogen, Cat No. 15596018)
2. Chloroform (SIGMA, Cat No. C2462)
3. Isopropyl alcohol (SIGMA, Cat No. I9030)
4. Ethanol (EtOH)
5. DEPC water

 

Method

 

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1. RNA isolation 하고자 하는 세포를 1.7ml e-tube에 넣고 centrifugation 하여 down 시킨다.
2. Cell prep. 을 제외한 상층액을 최대한 제거해주고 PBS를 1ml 넣고 가볍게 흔들어준다.
3. 다시 한번 centrifugation 하여 세포를 down 시키고, PBS를 완전히 제거한다.
   (실험을 멈추고자 한다면 이 과정에서 -20 ~ -80℃ 에 cell prep. 를 보관한다.)
4. TRIzol Reagent를 1ml 넣고 cell를 깨 준다. (Vertex를 하거나 pipette으로 up and down 해주면 cell prep이 사라지는 것을 확인할 수 있다.) 그러고 나서 room temperature (상온, RT)에서 5분 동안 정치한다.
5. TRIzol reagent가 들어있는 tube에 chloroform 200ul 넣어준다.
   (Chloroform 200ul는 TRIzol 1ml일 때 들어가는 양이다.)
6. Vertexing 15초간 진행하고, RT에서 3분 정치한다. 그러고 나서 centrifuge (12,000xg, 15분, 4℃)를 진행한다.
7. 위의 그림에서처럼 층 분리가 되면 가장 윗 층의 투명한 층을 새로운 e-tube에 옮긴다.
   (이때, TRIzol이 함께 옮기지 않도록 주의한다. 처음에 cell prep. 의 양이 많아 RNA가 많이 나올 것으로 판단될 경우는 투명한 층을 일부 남기는 식으로 안전하게 옮기는 것을 추천한다.) 
8. 투명한 층만 들어있는 e-tube에 isopropyl alcohol를 500ul 넣어주고 inverting (가볍게 흔들어줌) 15 - 30회 정도 진행한다.
9. RT에서 10분간 정치하고 centrifuge (12,000xg, 10분, 4℃)를 진행한다.
10. Centrifuge가 완료되면 상층액을 제거한 후, 75% ethanol (EtOH) 1ml를 넣고 vertexing 한다.
11. Centrifuge (7,500xg, 5분, 4℃)를 진행한다.
12. Centrifuge가 끝나면 상층액을 최대한 제거한다. (아래쪽에 prep. 이 있는 것을 확인하면서 진행해야 한다.)
13. 5 - 10분 동안 e-tube 뚜껑을 열어둬 ethanol를 완전히 말린다.
    (이때 ethanol이 완전히 마르면 prep의 색이 하얀색에서 투명하게 바뀐다. 이 과정을 제대로 안 하면 RNA를 정량할 때 purity가 낮게 나오기 때문에 완전히 말려줘야 한다. 또한 말리는 시간을 너무 오래 하면 prep이 녹지 않기 때문에 상층액을 제거할 때 최대한 많이 제거한 상태에서 말리는 과정을 들어가야 한다.)
14. 완전히 말린 것을 확인한 후 DEPC water로 RNA를 녹여준다.
15. Nano drop 등으로 RNA의 purity와 양을 측정한다. (260/230의 값이 1.6 이상은 나와야 한다.)

** 위의 그림과 조금 다른 부분이 있습니다. 위의 그림은 조금 더 알아보기 쉽게 찾아온 그림입니다. 아래 작성한 글처럼 진행하셔도 무방합니다.**

 

** 궁금하신 점은 댓글 달아주세요^^ 이번 실험도 잘 되길 기도하겠습니다!!**