Immunocytochemstry (ICC)_실험방법

Material

 

1. 1st & 2nd Antibody (실험에서 확인하고자 하는 protein에 specific binding 하는 antibody를 선정)
2. Slide & Cover glass
3. DAPI or Hochest
4. Paraformaldehyde (Biosesang, P2031)
5. PBS
6. Triton X-100 (SIGMA, T8787)
7. Normal Horse serume (NHS) (VECTOR, S-2000)
8. Mounting solution (Prolong gold antifade reagent) (Molecular probes, P36931)

 

 

Method

 이 실험은 2일에 거쳐서 실험을 진행합니다. 하루만 진행할 수도 있지만 antibody가 target protein이 아닌 non specific protein에 붙어서 불필요한 부분에 staining 이 될 가능성이 높아지기 때문에 이틀에 걸쳐 실험을 진행한 것을 추천드립니다.

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<1일차 실험>

 

Fixation

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1. 준비한 세포를 PBS를 이용하여 washing를 3회 진행한다.
2. 4% paraformaldehyde (PFA) or formaldehyde (FA) (in PBS)를 처리하여 room temperature (RT)에서 10분 동안 유지한다.
3. PBS 3회 washing를 진행한다. (실험을 진행하지 않고 sample를 저장하고 있고 싶다면 이 과정을 끝내고 PBS를 충분히 채워 넣고 well이 마르지 않게 실링하여 4도에서 보관한다.)

​Permeabilization

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1. 0.1% Triton X-100 (in PBS)를 5분 동안 처리한다 (RT).
2. PBS washing를 5분 간격으로 3회 진행한다.

Blocking

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1. 1% Normal horse serum (NHS) (in PBS)를 1시간 RT에서 처리한다. (NHS는 보고자 하는 protein의 host와 antibody의 host, species에 따라 변경하여 사용한다. 예들 들어, Mouse 세포에 protein를 확인하기 위해서는mouse serum은 사 용하면 안 된다.)

 

Antibody incubation (1st Antibody)

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1. 1% NHS에 1st antibody를 희석하여 세포가 담겨있는 well에 넣어준다. 그러고 나서 4℃에서 overnight 해준다. 이때 가만히 정치하는 것이 아니라 shaking를 해주는 것이 좋다.

 

 

 

<2일차 실험>

 

Antibody incubation (2nd Antibody)

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1. 1st Antibody를 최대한 씻어 내기 위해 PBS washing을 3회 진행한다. 5분 간격으로 PBS를 교체해주면서 진행한다.
2. 2nd Antibody를 1st Antibody 때와 마찬가지로 사용하고자 하는 제품의 deta sheet를 참고하여 1% NHS에 희석하고 처리한 후 1시간 동안 RT에서 shaking 하면서 반응시킨다.
3. PBS로 3회 5분 간격으로 washing 해준다.

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핵 염색

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1. DAPI (or Hochest)를 1% NHS에 deta sheet에 명시한 조건으로 희석하고 sample에 처리하여 10분 동안 RT에서 반응시킨다.
2. PBS로 10분 간격으로 3회 washing을 진행한다.

 

Mounting & imaging

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1. Mounting solution를 slide glass에 한방을 떨어뜨린 후 세포가 올라가 있는 cover slide를 들어서 PBS를 최대한 제거하고 slide glass와 cover slide 사이에 세포가 위치하도록 cover slide를 뒤집에서 기포가 들어가지 않도록 주의하며 살살 덮어준다.
2. 어두운 환경을 유지한 상태로 mounting solution을 발린다. (여기서 보통 overnight 하는 편이다.)
3. Mounting solution 이 마른 것을 확인한 후 투명 매니큐어로 cover slide 가장자리를 공기가 들어가지 않도록 잘 발라준다. (이때 너무 안쪽까지 많은 부분에 매니큐어가 발라지면 형광 사진 촬영하는 과정에서 정확한 이미지를 얻을 수 없니까 최대한 cover slide 안쪽으로 많이 발라지지 않도록 주의한다.)
4. 해당 sample를 형광현미경 및 confocal 장비를 이용하여 촬영한다. (사진 촬영은 실험자의 상황에 따라 장비 및 여건이 다른 경우가 많기 때문에 해당 기관의 장비 관리자에서 문의하여 진행하시면 됩니다.)

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유의점!!

 Immunocytochemistry는 많은 실험실에서 진행하고 있으며 기본적인 방법과 원리는 같으나 실험실에 따라 세부적인 방법은 달리질 수 있습니다. 이 글의 방법을 그대로 진행해도 실험은 문제없이 진행되지만 실험실에서 사용하는 방법을 이용하여 실험하시는 것을 추천드립니다.

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혹시 궁금한 것 있으시면 댓글 달아주세요~ 아는 데로 답변드릴게요^^

 

모두 원하시는 결과 얻기를 기원하겠습니다^^ 파이팅!

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참고

https://www.novusbio.com/support/support-by-application/immunocytochemistry/protocol.html